Povzetek Doktorata

Dr. Toni Petan

Department of Molecular and Biomedical Sciences
Jozef Stefan Institute
Jamova 39
SI-1000 Ljubljana
Slovenia

tel.: +386 1 477 33 06
fax: +386 1 477 39 84

email: toni.petan{at}ijs.si

Nevrotoksično in encimsko delovanje modrasovih fosfolipaz A₂

(Toni Petan, povzetek doktorske disertacije)

Strup modrasa, Vipera ammodytes ammodytes, vsebuje tri presinaptično nevrotoksične sekretorne fosfolipaze A₂ (sPLA₂), amoditoksine A, B in C (AtxA, B in C), miotoksičen encimsko neaktiven homolog sPLA₂, amoditin L (AtnL), ter netoksični sPLA₂, amoditina I₁ in I₂ (AtnI₁ in I₂). Encimska aktivnost presinaptično nevrotoksičnih sPLA₂ je nujna za polno izražanje njihove toksičnosti, njena točna vloga pri še ne v celoti poznanem molekulskem mehanizmu presinaptične nevrotoksičnosti pa je še vedno nejasna. Želeli smo ugotoviti vpliv površinskih hidrofobnih in aromatskih ostankov na stični vezavni površini (IBS) modrasovih sPLA₂ na njihove encimske in toksične lastnosti. V ta namen smo pripravili mutante AtxA, pri katerih smo zamenjali aromatski ostanek Phe24 s petimi ostanki različnih lastnosti, in mutant, pri katerem smo zamenjali Val31 s Trp. Z zamenjavo enega ostanka v aktivnem mestu in treh v Ca²⁺-vezavni zanki AtnL pa smo uspešno pripravili tudi dva encimsko aktivna mutanta AtnL, ki sta se med seboj razlikovala le v zamenjavi V31W. S podrobno analizo encimskih lastnosti 16 kačjih naravnih in mutiranih sPLA₂ iz skupine IIA (Atx, Atn in šibko nevrotoksična sPLA₂ iz Russllovega gada), predvsem afinitete vezave in encimske aktivnosti na definiranih fosfolipidnih agregatih ter afinitete vezave Ca²⁺-iona, smo hoteli ugotoviti, če obstajajo razlike v encimskem delovanju nevrotoksičnih in ne-nevrotoksičnih kačjih sPLA₂.

Ugotovili smo, da so amoditoksini zelo učinkoviti encimi pri delovanju tako na anionskih kot na nevtralnih membranskih površinah. Anionski fosfolipidni vezikli fosfatidilglicerola (PG) in fosfatidilserina (PS) predstavljajo zelo dobre substrate za amoditoksine. Encimske aktivnosti kačjih sPLA₂ na nevtralnih veziklih fosfatidilholina (PC) so bile tudi do 5 redov velikosti nižje od aktivnosti na omenjenih anionskih veziklih. Aktivnosti uporabljenih encimov so se na veziklih PC razlikovale tudi do 20.000-krat, na anionskih veziklih PG oz. PS pa največ do 11-krat oz. 34-krat.

Prisotnost anionskih fosfolipidov (PS) v nevtralnih membranskih površinah, bogatih s PC, je močno vplivala na povišanje encimske aktivnosti kačjih sPLA₂, predvsem zaradi povišanja afinitete vezave na te membranske površine. Ugotovljene afinitete vezave kačjih sPLA₂ na membranske površine nehidrolizabilnih veziklov, sestavljenih iz mešanic PS in PC, so se namreč dobro ujemale z aktivnostmi na hidrolizabilnih veziklih enake sestave. Aromatski ostanki na IBS-u kačjih sPLA₂ (Phe24, Phe124, Trp31 in Tyr119) imajo pomembno vlogo pri produktivni vezavi encima tako na nevtralne kot na anionske membranske površine, njihov relativni prispevek k vezavi pa je odvisen od lokacije ostanka na površini IBS-a, orientacije stranske verige ter od prispevka ostalih ostankov na IBS-u. Prisotnost polarnih in bazičnih ostankov na določenih mestih (24, 118 in 119) IBS-a kačjih sPLA₂ pa ima lahko izrazito negativen vpliv na vezavo encimov na nevtralne membranske površine, bogate s PC, in s tem na encimsko aktivnost. Phe24 ima pomembno vlogo tako pri encimski aktivnosti kot pri nevrotoksičnosti AtxA, ne sodeluje pa v veliki meri pri vezavi na specifična nevronska receptorja R25 in R180 ter na kalmodulin. Ostanek na mestu 31 ima lahko izredno velik vpliv na encimsko aktivnost, kaže pa relativno majhen prispevek k nevrotoksičnosti amoditoksinov. Razlika v letalnosti dveh encimsko aktivnih mutantov miotoksičnega AtnL, ki bi z encimsko aktivnostjo lahko pridobila tudi možnost nevrotoksičnega delovanja, je lahko posledica 40-kratne razlike v njuni encimski aktivnosti na nevtralnih membranskih površinah.

Amoditoksini lahko dosežejo visoko encimsko aktivnost že v prisotnosti mikromolarnih, in ne nujno milimolarnih, koncentracij Ca²⁺-ionov in kažejo relativno visoko stabilnost pri razmeroma močno redukcijskih pogojih, primerljivih s tistimi v citosolu sesalskih celic. V primerjavi z AtxA je imel netoksičen AtnI₂ 14-krat nižjo afiniteto vezave Ca²⁺, mutant AtxA(F24N), ki je bil 133-krat manj toksičen od AtxA, pa je pokazal 8-krat nižjo afiniteto. Glede na nizko afiniteto vezave, nizko encimsko aktivnost na veziklih, ki vsebujejo PS, in nizko afiniteto vezave Ca²⁺-iona netoksičen AtnI₂ vsekakor izstopa iz skupine sPLA₂, uporabljenih v tej študiji. V primerjavi z bazičnimi amoditoksini ima AtnI₂ izrazito nevtralno površino IBS-a in ne vsebuje bazičnih ostankov v njeni okolici, kar nakazuje na njegove omejene možnosti tvorbe izrazitejših elektrostatskih interakcij pri vezavi na membranske površine, poleg tega pa je nizka encimska aktivnost AtnI₂ na veziklih, ki vsebujejo PS, verjetno posledica tudi slabše vezave fosfolipidne glave PS v aktivno mesto te netoksične sPLA₂.

Amoditoksini so, v primerjavi s sesalskimi (netoksičnimi) sPLA₂, zelo učinkoviti encimi in zelo specifični ter močni toksini. Njihova visoka afiniteta vezave in visoka encimska aktivnost na različnih membranskih površinah, pa tudi možnost delovanja pri nižjih koncentracijah Ca²⁺ ter stabilnost pri močno redukcijskih pogojih, je zato najverjetneje ključnega pomena v neki točno določeni stopnji procesa presinaptične nevrotoksičnosti. V primeru vstopa presinaptično nevrotoksičnih sPLA₂ v citosol nevronske celice, kjer je njihovo encimsko delovanje časovno (redukcijski pogoji) in prostorsko (lokalna koncentracija Ca²⁺) omejeno, bi, poleg nizke afinitete netoksičnega AtnI₂ za vezavo Ca²⁺-iona, lahko tudi nizka afiniteta za vezavo na membrane, ki vsebujejo PS, odločilno vplivala na nezmožnost toksičnega delovanja AtnI₂.

Nazaj