Po tem, ko so sredi sedemdesetih let v laboratorijih prvic uspeli
prenesti gen, ki je nosil zapis za tocno doloceno beljakovino,
iz enega mikroorganizma v drugega, se je v biokemijskih laboratorijih
po vsem svetu zacelo novo obdobje raziskav. Ta dosezek je dokazoval,
da so znanstveniki tedaj v osnovi razumeli reakcije, potrebne
za obstoj in razmnozevanje organizmov, torej tiste procese, ki
potekajo v zivih celicah vsak trenutek: delitev DNA, prepisovanje
v RNA in prevajanje v proteine. Hkrati pa so poznali tudi encime,
ki sodelujejo pri izrezovanju košckov DNA, njihovem ponovnem
spajanju in pri podvojevanju in prepisovanju. Vse to znanje, ki
se je v osemdestih letih še bistveno izpopolnilo, je temelj
tako imenovanemu genskemu inzeniringu, ki nam danes omogoca, da
proizvedemo posamezno clovesko beljakovino v bakterijah, kvasovkah,
ali pa v gojenih insektnih ali sesalskih celicah. Razen tega danes
znanstveniki lahko transformirajo zivali ali rastline tako, da
na osnovi na novo vnesenih genov proizvajajo njim nelastne beljakovine.
Tega pa raziskovalci ne pocnemo iz kaksne objestnosti, temvec
zato, ker lahko s pomocjo rekombinantnih beljakovin ali s studijem
transgenih organizmov (to so organizmi, v katere smo vnesli tuj
gen na tak nacin, da ga bodo lahko podedovali tudi njihovi potomci)
razjasnimo masikateri doslej nerazumljen nacin delovanja posameznih
beljakovin, predvsem pa njihove interakcije z drugimi molekulami
in nacine regulacije znotraj posameznih celic, pa tudi organizmov.
V prvi polovici osemdesetih let je v svetu vecina naprednih laboratorijev,
ki so se ukvarjali s proteinsko biokemijo, zacela z raziskavami
na podrocja genskega in proteinskega inzeniringa. Odsek za biokemijo
Instituta "Jozef Stefan" je v letu 1986 zacel s prvimi
raziskavami na tem podrocju, sprva v sodelovanju z Institutom
za biokemijo Medicinske fakultete, kmalu pa ze samostojno in s
pomocjo znanja, ki so ga nasi sodelavci prinesli iz Nemcije in
Zdruzenih drzav Amerike. ze v letu 1988 smo objavili prvi clanek
s tega podrocja. V njem smo porocali o pripravi rekombinantnega
stefina B, sorazmerno majhne beljakovine, ki smo jo nekaj let
prej odkrili na nasem odseku (in nosi ime po institutu) in ki
ima lastnost, da zavira delovanje nekaterih encimov. Sestaviti
nam je uspelo sintetski gen z zapisom za cloveski stefin B in
na osnovi gena pripraviti to beljakovino v bakterijskih celicah.
Znanje in obseg dela sta se v zacetku devetdesetih let toliko
povecala, da se je odsek preimenoval v Odsek za biokemijo in molekularno
biologijo, od prvotnih izolacij in dolocanja kemijskih lastnosti
beljakovin pa je odsek bolj in bolj prehajal na raziskave celicnih
procesov in vloge posameznih encimov pri tem. Najsodobnejse aparature
za dolocanje aminokislinskega zaporedja beljakovin, cirkularnega
dikrografa in rentgenskega refraktometra omogocajo vpogled v strukturo
beljakovin od zaporedja aminokislin, preko nacina, kako se te
aminokisline med seboj nizajo v urejene strukture, do trodimenzionalne
predstavitve velikih molekul in nacrtovanja molekul, ki se vezejo
na beljakovine. Skupina biokemikov na Institutu "Jozef Stefan"
se danes lahko kosa z najboljsimi laboratoriji za raziskovanje
strukture in funkcije proteinov v Evropi.
V vecini zivih celic, tudi cloveskih, beljakovine neprestano nastajajo
in se neprestano razgrajujejo. Raziskovalce na nasem odseku zanimajo
predvsem poti razgradnje celicnih beljakovin: razumeli bi radi
kompleksno naravo same cepitve velikih proteinskih molekul do
kratkih fragmentov in aminokislin, ki jih lahko celica porabi
za ponovno sintezo novih beljakovin, hkrati pa nacine regulacije
tovrstne razgradnje, saj je zelo pomembno, da celica razgradi
le beljakovine, ki ji niso potrebne. Razen tega nas zanima delovanje
proteaz - encimov, ki razgrajujejo beljakovine - pri mnogih boleznih,
od katerih je nasa pozornost najpogosteje usmerjena na rakasta
obolenja, saj je vloga teh encimov pri siritvi in metastaziranju
tumorjev ze dokazana. Za encime je znacilno, da so zelo aktivne
molekule, saj lahko ena molekula encima cepi na tisoce molekul
beljakovine, ki jo razgrajuje. Ker so encimi tako aktivni, jih
celica za brezhibno delovanje potrebuje zelo malo, to pa seveda
otezkoca njihov studij. Osnovno razumevanje delovanja encimov
je mogoce samo, ce jih studiramo v cisti obliki. Zato moramo encime
iz celic najprej izolirati in pogosto jih je v celicah tako malo,
da jih v zapletenih in dolgotrajnih postopkih (vlecejo se lahko
vec tednov ali celo mesecev) uspemo iz enega kilograma tkiva izolirati
komaj nekaj mikrogramov. Za studij encimov, se posebej cloveskih,
ki jih je tezko pridobiti iz naravnih tkiv, je genski inzeniring
ponudil pravo resitev, saj lahko te redke beljakovine pridobimo
v enakem casu v tisockrat vecjih mnozinah. Iz celic izoliramo
gen, ki nosi informacijo za sintezo encima, ta gen preko tocno
definiranih vektorjev vstavimo v bakterjske celice in bakterije
bodo zacele proizvajati rekombinantni encim na osnovi gena, ki
smo ga npr. izolirali iz cloveskih celic. Bakterije lahko v laboratoriju
v nekaj dneh proizvedejo vec sto miligramov rekombinantne beljakovine,
postopki ciscenja pa so pogosto enostavnejsi kot so tisti, ki
so jih raziskovalci razvili za ciscenje encimov iz zivalskih ali
rastlinskih tkiv.
Osnovne raziskave na nasem podrocju lahko privedejo tudi do nekaterih
prakticnih zakljuckov. ceprav je vecina raziskovalnega dela na
odseku usmerjenega na znotrajcelicne proteaze, smo se v enem od
raziskovalnih projektov lotili studija kimozina, to je encima,
ki povzroca sesirjenje mleka, in ga uporabljajo pri proizvodnji
sirov. Mlekarji uporabljajo za svoje delo razlicne preparate.
Dolgo so mleko sirili tako, da so mu dodali izvlecek iz telecjih
zelodcev. Tak ekstrakt je bil zelo heterogen in je razen nujno
potrebnega kimozina vseboval se mnoge druge sestavine. Ko smo
raziskovali kimozin pri govedu in drobnici, smo ugotovili, da
se goveji in ovcji encim med seboj nekoliko razlikujeta, ceprav
je res, da lahko z govejim encimom sesirimo ovcje mleko in obratno.
Na odseku smo ob raziskavah delovanja obeh encimov razvili tudi
postopek, po katerem lahko proizvedemo cist rekombinantni ovcji
kimozin s pomocjo zdravju neskodljivih laboratorijskih sevov bakterije
Escherichia coli. Postopek smo patentirali in v poskusni proizvodnji
v sodelovanju z Biotehnisko fakulteto tudi dokazali, da je z rekombinantnim
ovcjim kimozinom mogoce pripraviti zelo kvaliteten in okusen sir.
Vecina dela v gensko tehnoloskih laboratorijih pa je se vedno
usmerjenega v temeljne raziskave. Da bi razumeli delovanje encimov,
nam je v veliko pomoc, ce lahko raziscemo prostorsko strukturo
teh molekul. Beljakovine so v vecini primerov kroglaste molekule
s premerom nekaj 10 nm, ki imajo povrsino nagubano in posejano
z rezami in izrastki. Kot trodimenzionalne molekule jih lahko
prikazemo po tem, ko smo iz uklonskih zarkov rentgenske svetlobe,
ki seva skozi kristal beljakovine, izracunali razdalje med posameznimi
atomi, ki sestavljajo molekulo. Govorimo o rentgenskih strukturah
beljakovin, gre pa za trodimenzionalno strukturo, ki kaze, katere
aminokisline so na povrsini in katere na mestih, ki so odlocilna
za delovanje teh beljakovin. Prepoznamo lahko vezavna mesta za
druge molekule, razumemo lahko, zakaj proteaza cepi samo nekatere
vrste beljakovin, drugih pa ne in zakaj nekatera protitelesa spoznajo
le dolocene dele beljakovin. (Podobne rezultate, vendar za zdaj
le pri manjsih proteinskih molekulah, nam daje tudi analiza beljakovin
z jedrsko magnetno resonanco.) Da pa eksperimentalno poiscemo
pogoje, pri katerih bo protein tvoril kristal, kakrsnega rabimo
za dolocanje rentgenske strukture, potrebujemo v povprecju vsaj
10 mg beljakovine. Pred uporabo tehnik rekombinantne DNA bi bilo
prakticno nemogoce dobiti dovolj nekaterih proteaz v cisti obliki,
da bi sploh lahko pomislili na kristalizacijo. Zdaj temu ni vec
tako.
V nasi raziskovalni skupini nam je v preteklem letu uspelo v bakteriji
Escherichia coli pripraviti rekombinantni prokatepsin B, to je
neaktivno obliko enega od znotrajcelicnih proteoliznih encimov,
ki v celicah po odcepu priblizno ene tretjine molekule preide
v aktiven encim. Ta je sposoben cepiti mnoge celicne beljakovine
in dokazali so, da je pomemben pri procesu metastaziranja tumorjev.
Rekombinantni prokatepsin B smo kristalizirali in na osnovi kristala
dolocili njegovo prostorsko strukturo. To je bil prvi cloveski
proencim iz skupine cisteinskih proteaz (v aktivnem mestu imajo
aminokislino cistein), katere kristalna struktura je bila objavljena,
na kar smo se posebej ponosni. Pokazalo se je, da je proencim
neaktiven zato, ker tista tretjina molekule, ki se kasneje v celici
odcepi, kot debela nit prekriva rezo, v kateri lezijo aminokisline
aktivnega centra in tako onemogoca dostop beljakovinskim substratom.
Ugotovili smo tudi, da je prakticno nemogoce, da bi se proencim
sam aktiviral do zrele, aktivne oblike, saj mesto, kjer se proencim
precepi, lezi dalec od aktivnega mesta.
Znanje, ki smo ga pridobili pri raziskavah znotrajcelicnih proteaz
smo lahko s pridom uporabili, ko smo v sodelovanju s farmacevtsko
tovarno Krka iz Novega mesta razvili komplete kemikalij, ki omogocajo
imunokemijsko dolocanje koncentracij posameznih proteaz ali inhibitorjev
(beljakovin, ki zavirajo delovanje proteaz) v vzorcih seruma ali
celicnih ekstraktih, dobljenih pri biopsiji pacientov z rakom.
Dokazali smo, da so mnoge proteaze zanesljiv prognosticni pokazatelj:
koncentracija teh beljakovin v vzorcih nam pove, kaksne so moznosti
pacienta za daljse prezivetje in s tem odlocilno pomagajo zdravnikom
pri izbiri najprimernejse terapije. Kompleti kemikalij vsebujejo
tudi kontrolni protein, na podlagi katerega klinicni in raziskovalni
laboratoriji umerjajo teste. Kontrolni proteini so rekombinantni
cloveski proteini, dobljeni iz bakterijskih celic. V sodelovanju
z Zavodom za transfuzijo krvi pa smo razvili teste za dolocanje
krvnih skupin s pomocjo monoklonskih protiteles. Teste so kasneje
na Zavodu izpopolnili in jih uporabljajo pri svojem rutinskem
delu.
Poseben problem predstavlja razumevanje delovanja beljakovin,
ki imajo vec funkcij in interagirajo z vec tarcnimi molekulami.
Ena od takih beljakovin je fosfolipaza iz modrasovega strupa.
Fosfolipaze so encimi, ki razgrajujejo elemente celicnih membran,
vendar pa neodvisno od te encimske aktivnosti delujejo tudi kot
toksini. Da bi razumeli, kako je to mogoce, smo pred leti pripravili
vec monoklonskih protiteles, ki so zakrila tocno dolocena obmocja
na povrsini molekule. Poskusali smo ugotoviti, katera protitelesa
po vezavi na fosfolipazo ugasnejo encimsko aktivnost in katera
toksicno delovanje. Vendar pa popolnega odgovora s tem pristopom
nismo dobili. Ko nam je uspelo pripraviti rekombinantno modrasovo
fosfolipazo v bakterijah (kar smo naredili tako, da so bakterije
proizvajale nestrupene molekule, ki smo jih najprej iz bakterij
izolirali, potem pa sele aktivirali), je bila pot do resitve problema
odprta. Gen za fosfolipazo lahko modificiramo tako, da na tocno
dolocenih mestih zamenjamo eno ali vec baz, s temi mutacijami
pa spremenimo zaporedje aminokislin v rekombinantni beljakovini.
ce spremenimo tiste aminokisline, za katere predvidevamo, da so
v aktivnem mestu encima oziroma tiste, ki so v toksicnem centru,
lahko na podlagi encimske in toksicne aktivnosti mutirane fosfolipaze
ugotovimo, ali so nase predpostavke pravilne. Trenutno se ukvarjamo
s testiranjem vec mutant, pri katerih studiramo tako encimsko
aktivnost kot njihovo toksicnost, pa tudi vezavo na receptorje,
velike molekule na celicni povrsini, ki so bistvene za toksicno
delovanje fosfolipaz.
Genska tehnologija omogoca tudi dolocanje zaporedja (sekvence)
baz v genih. Geni nosijo zapis ne le za beljakovine, pac pa tudi
informacijo o tem, kako pogosto, v katerih celicah in v kateri
razvojni fazi se bo gen prepisoval. Dolocanje zaporedja baz nam
tako lahko odgovori na vprasanja, ki jih proteinska biokemija
ne bi mogla razresiti. Razen tega lahko primerjava sekvenc med
razlicnimi organizmi pojasni nekatera zanimiva opazanja v zvezi
z evolucijo. Tako smo na primer ugotovili, da je nek tocno dolocen
vkljucek v kromosomski DNA (retropozon ART-2) nenavadno podoben
pri plazilcih in govedu. Ob klasicnem poteku evolucije bi bilo
to prakticno nemogoce. Podobni primeri znotraj posameznih vrst
so sicer znani, to pot pa gre za poseben nacin prenosa genov med
filogenetsko oddaljenima razredoma, ki doslej ni bil znan.
Ko smo preucevali odziv strocnic na suso in krompirja na poskodbe
in virusne bolezni, smo opazili, da pogosto pride do povecanja
koncentracije nekaterih proteaz in inhibitorjev. Ob tem smo osvojili
tudi tehnike, s katerimi lahko vnesemo tuje gene v rastlinske
celice. Pred kratkim nam je uspelo v laboratoriju pripraviti transgeni
krompir, ki nosi gen za clovesko proteazo. Ko nam bo uspelo dokazati,
da se gen za proteazo v rastlini tudi izraza kot beljakovina,
bo to omogocalo, da na cenen nacin pridobimo velike kolicine cloveskega
encima iz rastlinskih celic.
Brez kloniranja genov s pomocjo mikroogranizmov torej veliko aktualnih
vprasanj v biokemiji in molekularni biologiji ne bi bilo mogoce
resiti, saj je to edini nacin, kako pridobiti zadostne kolicine
izredno redkih beljakovin. Po drugi strani genski inzeniring omogoca
spreminjanje tocno dolocenih aminokislin v beljakovini. Pridobljene
mutante nam sluzijo kot modeli, ki edini lahko odgovorijo na vprasanje,
kateri deli beljakovinskih molekul so odgovorni za posamezne lastnosti
teh molekul. sele, ko razumemo, kako so encimi zgrajeni in kako
delujejo pa lahko nacrtujemo snovi, ki so sposobne delovanje encimov
zavreti. Pri mnogih boleznih, med katere sodi na primer osteoporoza,
pride do razvoja bolezni zaradi prekomernega delovanja nekaterih
proteaz. Molekule, ki bi ustavile to skodljivo delovanje bi lahko
uporabili kot zdravilo.
Gensko tehnologijo na siroko uporabljajo v vseh sodobnih laboratorijih
s podrocja proteinske biokemije in celicne biologije, pa tudi
v nekaterih aplikativnih panogah, in med njimi je tudi vse vec
slovenskih raziskovalnih skupin. Odsek za biokemijo in molekularno
biologijo Instituta "Jozef Stefan" ima na tem podrocju
veliko znanja in izkusenj, o uspehih s tega podrocja pa pricajo
clanki, objavljeni v najuglednejsih mednarodnih revijah.