glava
predstavitev
podrocja
sodelavci
reference
obvestila

Biotehnologija mlečnokislinskih bakterij:

Mlečnokislinske bakterije so že tisočletja spremljevalke človeške rase, predstavljajo sestavni del naše prehrane in so industrijsko ene od najpomembnejših mikroorganizmov. Znana so številna poročila o njihovem pozitivnem vplivu na zdravje, saj predstavljajo sestavni del koristne mikrobiote in sodelujejo pri tvorbi pomembnih hranil. Zato se pogosto dodajajo prehrani kot probiotiki. Ker imajo splošno priznan varen status (»generally recognized as safe« - GRAS), postajajo pomembne tudi kot gostiteljski organizem v biotehnologiji in kot potencialni vektor za dostavo biološko aktivnih učinkovin v organizem v medicini. 

Površinska predstavitev na mlečnokislinskih bakterijah

Prvi pristop, ki ga uporabljamo, vključuje uporabo fuzijskih proteinov, sestavljenih iz treh delov: signalnega proteina za izločanje (Usp45), predstavljenega potniškega proteina in peptidoglikan-vezavne domene (C-terminalni del proteina AcmA s tremi LysM ponovitvami).

Drugi pristop k površinski predstavitvi na bakteriji L. lactis je vključeval iskanje kandidatnih laktokoknih proteinov, ki bodo lahko služili kot nosilni proteini za površinsko predstavitev. S površinskim britjem smo določili površinski proteom  in ga primerjali z bioinformacijsko napovedjo. 7 kandidatnih proteinov smo klonirali, izrazili v bakteriji L. lactis in detektirali na bakterijski površini. BmpA je bil predstavljen v največjem obsegu in je bil uspešno uporabljen kot nosilec za kovalentno površinsko predstavitev modelnega proteina. Zmanjšana različica Bmp1 je omogočila boljšo predstavitev, medtem ko je nadaljnje krajšanje predstavitev poslabšalo.

Tretji pristop vključuje heterologno površinsko predstavitev na ne-rekombinantnih bakterijah. Izločene fuzijske proteine s površinskim sidrom se proizvede v bakteriji L. lactis in se jih nekovalentno pritrdi na površino laktobacilov. Lactobacillus salivarius ATCC11741 je še posebno primeren za takšen tip površinske predstavitve, ki se ga lahko še dodatno izboljša z dodatkom sub-inhibitornih koncentracij antibiotikov.

SDnonGMOBmpABmp1

Izbrane objave:

  • Berlec A, Zadravec P, Jevnikar Z, Štrukelj B. Identification of candidate carrier proteins for surface display on Lactococcus lactis by theoretical and experimental analyses of the surface proteome. Appl Environ Microbiol. 2011 Feb;77(4):1292-300.
  • Zadravec P, Mavrič A, Bogovič Matijasic B, Štrukelj B, Berlec A. Engineering BmpA as a carrier for surface display of IgG-binding domain on Lactococcus lactis. Protein Eng Des Sel. 2014 Jan;27(1):21-7.
  • Zadravec P, Štrukelj B, Berlec A. Improvement of LysM-mediated surface display of designed ankyrin repeat proteins (DARPins) in recombinant and nonrecombinant strains of Lactococcus lactis and Lactobacillus Species. Appl Environ Microbiol. 2015 Mar;81(6):2098-106.

Terapevtske aplikacije načrtovanih mlečnokislinskih bakterij

Lactococcus lactis se lahko uporabi kot vektor za dostavo terapevtskih proteinov na človeške mukozne površine. Za ta namen je uporabna vezava dostavljenih proteinov na bakterijsko površino. Z zamenjavo modelnega proteina s TNF alfa vezavnim afibodijem smo pridobili laktokokne celice s sposobnostjo vezave TNF alfa, ki bi jih bilo moč uporabiti za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni.

Dodaten cilj je razvoj oralnih cepiv proti infekcijskim boleznim. Tako smo razvili bakterijo L. lactis, s katero smo lahko dostavili antigen Hepatitisa A v mišji prebavni takt. Rekombinantne bakterije so sprožile mukozni in sistemski humoralni imunski odziv, pri čemer pa je bil le-ta nižji od tistega, ki smo ga dosegli s parenteralno apliciranim, očiščenim antigenom.  

Napisali smo tudi pregledna članka o terapevtski uporabi mlečnokislinskih bakterij in o vezalcih na osnovi ne-imunoglobulinskega ogrodja, ki bi jih lahko uporabili za dostavo v črevesje s pomočjo mlečnokislinskih bakterij.

Affibody binding scheme

HAV

Izbrane objave:

  • Ravnikar M, Strukelj B, Obermajer N, Lunder M, Berlec A. Engineered lactic acid bacterium Lactococcus lactis capable of binding antibodies and tumor necrosis factor alpha. Appl Environ Microbiol. 2010 Oct;76(20):6928-32.
  • Berlec A, Malovrh T, Zadravec P, Steyer A, Ravnikar M, Sabotič J, Poljšak-Prijatelj M, Štrukelj B. Expression of a hepatitis A virus antigen in Lactococcus lactis and Escherichia coli and evaluation of its immunogenicity. Appl Microbiol Biotechnol. 2013 May;97(10):4333-42.
  • Berlec A, Ravnikar M, Strukelj B. Lactic acid bacteria as oral delivery systems for biomolecules. Pharmazie. 2012 Nov;67(11):891-8.
  • Škrlec K, Štrukelj B, Berlec A. Non-immunoglobulin scaffolds: a focus on their targets. Trends Biotechnol. 2015 Jul;33(7):408-18.


Slikanje mlečnokislinskih bakterij

In vivo slikanje peroralno apliciranih mlečnokislinskih bakterij lahko zagotovi informacije o prostorski in časovni razporeditvi bakterij v gastrointestinalnem traktu in je še posebej pomembno pri spremljanju terapevtskih rekombinantnih bakterij. Bakterije smo detektirali preko izraženega infrardečega fluorescentnega proteina IRFP713. Vzpostavili smo tehniko fluorescenčne tomografije za prostorsko lokalizacijo fluorescentnih bakterij. Izražanje dodanega fluorescentnega proteina IRFP682 je omogočilo hkratno detekcijo dveh bakterijskih populacij v živih miših.
IRFP_3miceFLIT

Izbrane objave:

  •  Berlec A, Završnik J, Butinar M, Turk B, Štrukelj B. In vivo imaging of Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum and Escherichia coli expressing infrared fluorescent protein in mice. Microb Cell Fact. 2015 Nov 14;14(1):181. 

Nova raziskovalna orodja

Vse več aplikacij zahteva visoko-zmogljivostno kloniranje v bakteriji L. lactis. Opisali smo pripravo TA-klonirnega sistema na osnovi plazmida pNZ8148 z od nizina odvisnim sistemom za nadzorovano izražanje. TA-kloniranje omogoča neposredno ligacijo PCR produktov, pomnoženih s Taq polimerazo, ki vsebujejo 3’-adenozinske preostanke. Plazmid pNZ-T smo pridobili s PCR amplifikacijo celega plazmida pNZ8148 in XcmI razgradnjo. PCR produkte različnih velikosti smo uspešno klonirali v pNZ-T in več kot 95 % testiranih kolonij je vsebovalo plazmid z insertom.

TA_cloning

Izbrane objave:

  • Berlec A, Strukelj B.  Generating a custom TA-cloning expression plasmid for Lactococcus lactis. Biotechniques. 2012 Jan;52(1):51-3.
Izražanje sladkega proteina brazeina v bakteriji Lactococcus lactis

Brazein so odkrili v zahodnoafriški rastlini Pentadiplandra brazzeana Baillon in je najmanjši do sedaj odkriti protein sladkega okusa. V molekuli so štiri disulfidne vezi, ki so odgovorne za visoko termo- in pH-stabilnost molekule. Brazein je 2000-krat bolj sladek od saharoze na masni ravni. Njegov profil sladkosti je v primerjavi z drugimi proteini sladkega okusa bolj podoben saharoznemu. Zaradi intenzivnega sladkega okusa bi se lahko uporabljal kot alternativno sladilo naravnega izvora. Z izražanem brazeina v mlečnokislinskih bakterijah bi lahko odpravili potrebo po doslajevanju mlečnih izdelkov.


brazzein3dbrazzeinNICE

Izbrane objave:
  • Berlec A, Jevnikar Z, Majhenic AC, Rogelj I, Strukelj B. Expression of the sweet-tasting plant protein brazein in Escherichia coli and Lactococcus lactis: a path toward sweet lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 2006 Nov;73(1):158-65.
  • Berlec A, Tompa G, Slapar N, Fonović UP, Rogelj I, Strukelj B. Optimization of fermentation conditions for the expression of sweet-tasting protein brazzein in Lactococcus lactis. Lett Appl Microbiol. 2008 Feb;46(2):227-31.
  • Berlec A, Strukelj B. Large increase in brazzein expression achieved by changing the plasmid /strain combination of the NICE system in Lactococcus lactis. Lett Appl Microbiol. 2009 Jun;48(6):750-5.
Contact:
Aleš Berlec
Borut Štrukelj

clanki

trakl