glava
predstavitev
podrocja
sodelavci
reference
obvestila

Inhibitorji peptidaz iz gob


Peptidaze so encimi, ki cepijo peptidne vezi in so prisotne pri vseh organizmih. Igrajo pomembne vloge v mnogih fizioloških procesih; od enostavne prebave prehranskih beljakovin do kompleksnih procesov, kot so strjevanje krvi, programirana celična smrt, imunski odgovor, aktivacija hormonov in drugo. Zaradi njihovih pomembnih funkcij pri delovanju celic in organizmov so peptidaze vpletene tudi v mnoge patološke procese pri ljudeh, kot so rakava obolenja, sladkorna bolezen, mišična distrofija, multipla skleroza, revmatoidni artritis, osteoartritis, Alzheimerjeva bolezen itn. Poleg tega peptidaze predstavljajo tudi pomembne virulenčne dejavnike mnogih patogenih bakterij, virusov, gliv in zajedavcev. Uravnavanje delovanja peptidaz je torej življenjskega pomena. Eden pomembnejših mehanizmov uravnavanja njihove proteolitične aktivnosti je interakcija s specifičnimi peptidaznimi inhibitorji. Zato peptidaze in peptidazni inhibitorji predstavljajo pomembne tarče in orodja pri iskanju novih učinkovin za potencialno uporabo v medicini, farmacevtski industriji in kmetijstvu.

V naši skupini proučujemo inhibitorje cisteinskih peptidaz, inhibitorje serinskih peptidaz in ustrezne peptidaze iz naših modelnih gob poprhnjena livka ali meglenka (Clitocybe nebularis), orjaški dežnik (Macrolepiota procera) in gnojiščna tintnica (Coprinopsis cinerea). Naše raziskave so usmerjene v uporabo teh proteinov iz gob v medicini, biotehnoloških procesih in kmetijstvu.

C nebularis
M proceraC cinerea
Poprhnjena livka ali meglenkaOrjaški dežnikGnojiščna tintnica v petrijevki

Mikocipini, gobji inhibitorji cisteinskih peptidaz

Iz gobe meglenke (Clitocybe nebularis) smo sprva izolirali nov inhibitor cisteinskih peptidaz imenovan klitocipin. Zaradi posebnih lastnosti je bil uvrščen v novo družino inhibitorjev cisteinskih peptidaz I48 v klasifikaciji peptidaznih inhibitorjev MEROPS, katere edini opisan član je še danes. Nadaljnje iskanje podobnih inhibitorjev cisteinskih peptidaz je vodilo do izolacije družine inhibitorjev peptidaz imenovane makrocipini iz gobe orjaški dežnik (Macrolepiota procera), za katero je bila prav tako ustanovljena nova družina I85 v klasifikaciji MEROPS. Karakterizacija mikocipinov na genetskem nivoju je pokazala prisotnost genskih družin z visoko variabilnostjo zaporedij, pri čemer raznolikost zaporedij pri makrocipinih vpliva tudi na njihov inhibitorni profil. Inhibitorni spekter mikocipinov (klitocipin in makrocipini) obsega različne družine peptidaz, vključno s številnimi papainu podobnimi cisteinskimi peptidazami (družina C1, klan CA), cisteinsko peptidazo legumain (družina C13, klan CD) in serinsko peptidazo tripsin (družina S1, klan PA). Določitev kristalne strukture mikrocipinov je omogočila tudi določitev reaktivnih mest inhibitorjev odgovornih za inhibicijo posameznih peptidaz, kar smo potrdili tudi s pripravo neaktivnih mutant. Mikocipini, klitocipin (družina I48) in makrocipini (družina I85), imajo beta triperesno zvitje.

3D klitocipin3D kompleks3D makrocipin

Izbrane reference:


  • Sabotič J, Kilaru S, Budič M, Buh Gašparič M, Gruden K, Bailey A, Foster GD, Kos J. Protease inhibitors clitocypin and macrocypin are differentially expressed within basidiomycete fruiting bodies. Biochimie (2011) 93 (10): 1685-1693.
  •  Renko M, Sabotič J, Mihelič M, Brzin J, Kos J & Turk D. Versatile loops in mycocypins inhibit three protease families. J Biol Chem (2010) 285 (1): 308-316.
  • Sabotič J, Popovič T, Puizdar V & Brzin J. Macrocypins, a family of cysteine protease inhibitors from the basidiomycete Macrolepiota procera. FEBS J (2009) 276 (16): 4334-4345
  •  Sabotič J, Galeša K, Popovič T, Leonardi A & Brzin J. Comparison of natural and recombinant clitocypins, the fungal cysteine protease inhibitors. Protein Expr Purif (2007) 53 (1): 104-111. 
  • Sabotič J, Gaser D, Rogelj B, Gruden K, Štrukelj B & Brzin J. Heterogeneity in the cysteine protease inhibitor clitocypin gene family. Biol Chem (2006) 387 (12): 1559-1566.
  • Galeša K, Thomas RM, Kidrič M & Pain RH. Clitocypin, a new cysteine proteinase inhibitor, is monomeric: impact on the mechanism of folding. Biochem Biophys Res Commun (2004) 324 (2): 576-578.
  •  Brzin J, Rogelj B, Popovič T, Štrukelj B & Ritonja A. Clitocypin, a new type of cysteine proteinase inhibitor from fruit bodies of mushroom Clitocybe nebularis. J Biol Chem (2000) 275 (26): 20104-20109.

Gobji inhibitorji serinskih peptidaz

 Iz gobe meglenke (Clitocybe nebularis) smo izolirali tudi inhibitorje serinskih peptidaz CnSPI (C. nebularis serine protease inhibitors). Enega od njih, imenovanega knispin, smo natančneje karakterizirali. Pokazal je izredno specifičnost za inhibicijo tripsina. Funkcionalna analiza je pokazala, da ima knispin v gobi verjetno dvojno biološko vlogo, in sicer pri uravnavanju proteolitične aktivnosti endogenih peptidaz ter zaščitno vlogo pred žuželkami, ki jo napadajo. Knispin je prvi inhibitor serinskih peptidaz družine inhibitorjev I66 v klasifikaciji MEROPS, ki je karakteriziran na biokemijskem in genetskem nivoju ter nivoju biološke vloge. Karakterizacija podobnega inhibitorja peptidaz iz gnojiščne tintnice (Coprinopsis cinerea), kospina, je poglobilo razumevanje gobjih inhibitorjev tripsina. S pomočjo tridimenzionalne strukture smo pojasnili molekularni mehanizem inhibicije serinskih peptidaz, pri čemer smo ugotovili neverjetno raznolikost funkcionalnosti zank beta-triperesnega zvitja.

Izbrane reference:

  • Sabotič J, Bleuler-Martinez S, Renko M, Avanzo Caglič P, Kallert S, Štrukelj B, Turk D, Aebi M, Kos J, Künzler M. Structural basis of trypsin inhibition and entomotoxicity of cospin, a serine protease inhibitor involved in defence of Coprinopsis cinerea fruiting bodies. J Biol Chem (2012) 287 (6): 3898-3907.
  • Avanzo P, Sabotič J, Anžlovar S, Popovič T, Leonardi A, Pain RH, Kos J & Brzin J. Trypsin-specific inhibitors from the basidiomycete Clitocybe nebularis with regulatory and defensive functions. Microbiology (2009) 155 (Pt 12):3971-3981. 

Peptidaze iz gob

Preverili in primerjali smo slabo poznan proteolitični potencial prostotrosnic. Pokazali smo prisotnost vseh štirih glavnih katalitičnih razredov peptidaz, pri čemer prevladujejo serinske peptidaze. Prvič smo pri gobah pokazali prisotnost cisteinskih peptidaz. Ugotovili smo nepričakovano raznolikost in število peptidaz, katerih večina je neobčutljiva na standardne razredno specifične peptidazne inhibitorje. Nekatere so pokazale inhibicijo le z endogenimi glivnimi inhibitorji kot sta inhibitor cisteinskih peptidaz klitocipin in inhibitorji serinskih peptidaz CnSPI iz gobe meglenke. Nepričakovana raznolikost in število peptidaz s posebnimi lastnostmi nakazuje edinstvenost proteolitičnih encimov glivnega izvora. Delna karakterizacija aspartatnih peptidaz iz gobe meglenke (C. nebularis), ki so podobne peptidazam skupine A1.018 po klasifikaciji MEROPS, je dodatno potrdila raznolikost in bogastvo proteolitičnih encimov v gobah.

Izbrane reference:

  • Sabotič J, Trček T, Popovič T & Brzin J. Basidiomycetes harbour a hidden treasure of proteolytic diversity. J Biotechnol (2007) 128 (2): 297-307
  • Sabotič J, Popovič T & Brzin J. Aspartic proteases from basidiomycete Clitocybe nebularis. Croat Chem Acta (2009) 82 (4): 739-745

Uporaba gobjih peptidaz in peptidaznih inhibitorjev

Naše raziskave so usmerjene v uporabo gobjih peptidaznih inhibitorjev pri zaščiti poljščin, kjer v sodelovanju z drugimi skupinami proučujemo njihov vpliv na rast in razvoj različnih kmetijskih škodljivcev, vključno z žuželkami (koloradski hrošč, vinska mušica), polži, plesnimi in bakterijami.

Patentna prijava:

  • Istinič I, Buh Gašparič M, Sabotič J, Gruden K, Brzin J, Žel J. Uporaba makrocipinov kot pesticidnih učinkovin: številka prijave: P-201100304 z dne 10.8.2011. Ljubljana: Urad RS za intelektualno lastnino, 2011. 26 str.

Drugi sklop uporabe gobjih peptidaznih inhibitorjev vključuje raziskave na področju rakavih obolenj in imunskega odziva. Proteolitični encimi namreč igrajo pomembne vloge pri napredovanju tumorjev in tvorbi metastaz. Zaradi posebnih lastnosti ter njihove selektivnosti in specifičnosti lahko gobji peptidazni inhibitorji služijo kot orodja za razumevanje vlog posameznih peptidaz v različnih fazah razvoja tumorjev in metastaz ter kot osnova za načrtovanje in razvoj novih protirakavih ali imunomodulatornih terapij.

kol hroschifePC12

Affinity chromatography

Prosto dostopna knjiga Affinity Chromatography (Intech, 2012) z našim poglavjem "The Value of Fungal Protease Inhibitors in Affinity Chromatography", kjer smo opisali uporabo inhibitorjev peptidaz iz gob kot ligandov na različnih nosilcih pri afinitetni kromatografiji za izolacijo peptidaz.

Kontakt:
Jerica Sabotič

trak