Kaj bi to pomenilo?
Citati iz starih poročil, ki (upam,
da) govorijo sami zase. Mislim, da
je najbolje, da citate predelate po tem, ko ste posamezno vajo že
opravili.
Poskušajte ugotoviti, kaj je čudnega
v navedenih izjavah!
Če vam ne uspe, me vprašajte na naslednjih vajah!
Naloga II (primerjava metod za
izolacijo plazmidov)
- Izolirali smo super zvito DNA iz Escherichie coli.
- RNaza je bila premalo specifična, zato na gelu še vidimo ostanke
RNA.
- LiCl ima nekakšno RNazno aktivnost.
- Pri dodatku LiCl nimamo nič superzvite DNA (zelo verjetno je
prišlo do razgradnje le-te).
- Dodatek etidijevega bromida pred polimerizacijo ni vplival na
dolžino poti plazmidov.
- Prisotnost etid. bromida poveča elektroforezno mobilnost
plazmidne DNA.
- Na gelu z etid. bromidom vidimo še druge konformacije, ker je
etid. bromid denaturant.
- Na 1% gelu so fragmenti lažje potovali kot na 2%.
- 1% gel je boljši, ker so lise bolj narazen, kar lažje detektiramo.
- V žepkih, kjer smo dokazovali delovanje RNaz, opazimo naslednje:
/... / . Ob primerjavi žepka 1 in 4 opazimo, da je metoda s kuhanjem
bolj primerna. V žepku 5 je vzorcu dodan LiCl, v žepku 7 pa CTAB.
- Na prvo mesto v gelu RNaze nismo dodali, na drugo smo dodali
majhno količino, na tretje pa največjo količino RNaze.
- Na gelu je jasno vidna
kromosomska DNA v žepkih in RNA molekula, ki je v gelu pripotovala
najdalj. Vendar pa ti dve molekuli ne kažeta na razliko med 1% in 2%
agarozo.
- Vzorec 4 je bil pridobljen
s kuhanjem brez dodatkov.
- Sklepamo lahko celo, da je v zgornji lisi prisotna na kupu vsa
plazmidna DNA tik ob ostankih kromosomske DNA, tako da sta težko
ločljivi.
- Kontrola je encimska liza brez dodatka.
- Najbolje bi bilo dati v vzorec zelo nizko koncentracijo RNaze pri
krajši inkubaciji.
- RNA je bila precej fragmentirana.
- Bolje je, če dodamo manjšo koncentracijo RNaze.
- Intenzivnost lise RNA se zmanjša tudi ob dodatku CTAB, kar kaže
na manjšo količino izolirane RNA, kar smo tudi pričakovali, saj CTAB v
prisotnosti nizke koncentracije NaCl veže in obarja nukleinske kisline.
- Pri nanosih 5, 6 in 7 smo izolaciji s kuhanjem dodali v vsak nanos še enega od dodatkov.
- Lise 1b, 2b in 3b smo
obdelovali z RNazo, pri čemer je 1b kontrola (tu RNaza ni prisotna),
zaradi česar je RNA lepo vidna.
- Slika vzorca 7 je zelo slabo vidna; velik del komponent vzorca
smo verjetno izgubili med obdelavo zaradi nenatančnosti.
- Pri metodi s kuhanjem dobimo manj RNA, ker se je del med kuhanjem
denaturira.
- Z večanjem koncentracije RNaz se zmanjša količina RNA, ki je
potovala s fronto.
- Vpliv dodatka RNaze pri alkalni lizi: Celotni izkoristek reakcije
je največji v primeru alkalne lize brez dodatka RNaze, sledi vzorec
encimska liza brez dodatkov in pri skupini 2 vzorec encimska liza z
dodatkom LiCl, zato ker je imela največji izkoristek pri izolaciji, saj
v tem primeru nismo dodali RNaze.
- LiCl s povišano ionsko močjo povzroči obarjanje RNA z več kot 300
bp, kar vpliva na izboljšanje izolacije plazmidne DNA.
- Predvidevamo, da smo z LiCl uspešno oborili veliko količino RNA,
ki je bila v prvotnem vzorcu še prisotna. Metoda ni primerljiva z
metodo uporabe RNaze. Tu se RNA znebimo, v primeru dodatka RNaze se ta
le hitreje premika po gelu.
- Za RNA potuje plazmidna DNA z naraščajočo stopnjo superzvitosti.
Ker vemo, da hitrost migracije cirkularne dsDNA narašča z njeno stopnjo
superzvitosti, lahko na podlagi tega ugotovimo, katerim topološkim
oblikam
pripadajo posamezne lise.
- Po dodatku CTAB je v vzorcu manj RNA zaradi boljše izolacije DNA
v primerjavi z RNA.
- Glede na to, da se je pri dodatku CTAB v našem primeru izkoristek
zmanjšal, lahko sklepamo, da se je CTAB vezal na nukleisnke kisline.
- Vzorce smo nanesli na gel in počakali, da je bila elektroforeza
končana.
- Najhitreje so na gelu potovale majhne molekule RNA, in sicer
zaradi svoje majhnosti.
- RNA sledi scDNA, ki je po dolžini najkrajša.
- Ker gel ni vseboval EtdBr, smo lahko opazovali tudi
konformacijske oblike plazmidne DNA. Te se med sabo razlikujejo po
konformacijskih oblikah.
- Med kromosomsko DNA in RNA je nadzvita oblika.
- PEG je dober za DNA, ker omogoča vezavo encimov na DNA.
- Primerjava rezultatov pokaže, da smo največ DNA izolirali, če smo
dodali PEG, prav tako pa smo dobili tudi največ kontaminant.
- Etid. bromid poudari intenziteto lis, ker je barvilo, ki se
vgradi med bazne pare.
- Če bi vzeli še več EtdBr na koncu, bi bile lise še bolj vidne.
- Pri večini vzorcev so opazni repi, kar je slabo.
- Pri dodatku PEG je opaziti nekoliko večjo koncentracijo plazmidov.
- Dodatek PEG povzroči večji izkoristek plazmidne DNA; količina
preostale RNA je neopazna.
- Rezultati se bolj ali manj ujemajo s pričakovanji.
- Zadnji reagent je bil CTAB in tudi tu je DNA veliko bolj
prepoznavna, enako kot pri LiCl, le da ima več DNA.
- Pri nadaljnji obdelavi vzorca pa vidimo, da dobimo večji
izkoristek plazmidov pri obdelavi z RNazo kot pa pri obdelavi z
ostalimi dodatki.
- V literaturi je navedeno, da se CTAB veže na proteinske in
polisaharidne komponente celic v pogojih visoke ionske jakosti, v
pogojih nizke ionske jakosti pa na nukleinske kisline, iz česar lahko
sklepam, da se je pri pogojih, pri katerih smo izvajali naš poskus,
veliko DNA vezalo na CTAB in smo jo s tem izgubili.
- Rezultati gelčkov vidno prikažejo kako hitro se lahko zmanjša
izkoristek dela ali se ohrani večja količina nečistoč v našem vzorčku
zaradi manjših odstopanj v pripravi.
- Padec izkoristka je mogoče pričakovati pri vseh vzorcih kjer smo
bili večkrat temu tudi izpostavljeni.
Naloga III (izolacija plazmidne DNA v
srednjem obsegu)
- Rdeč kvadrat označuje del gela, kjer se nahajajo najini vzorci
(oziroma, kje bi bili, če bi jih bilo kaj).
- Slika 1 prikazuje nanos vzorcev po izolaciji večjih količin
plazmidne DNA na agarozni gel.
- Pričakoval sem, da bo pri 3x večjem nanosu vzorca tudi 3x večja koncentracija, do tega je tudi prišlo.
- V lisah 1 in 2 ni opaziti veliko
nečistoč (ozadja), saj so lise lepo vidne.
- Lise, ki sva jih s partnerko dobila, so v zgornjem desnem kotu.
- Spodnja lisa predstavlja superzvito obliko pDNA, zgornja lisa pa
preostalo pDNA. Skupaj predstavljata pDNA z maso 300 ng.
- Na gelu opazimo 2 kromosomski obliki DNA: spodnja lisa
predstavlja superzvito obliko. Zgornja lisa predstavlja DNA, ki se je
"ujela na primesi".
- Lise, ki jih vidimo, so večinoma posledica dodatno zvite plazmidne DNA, kromosomske DNA je manj.
- Na
vsaki izmed prog je opaziti več lis. Lisa z največjo molekularno maso
pripada DNA. To je DNA, ki je med izolacijskim postopkom plazmida,
preko večjih por ušla iz jedra in je prisotna pri nadaljnji obdelavi
vzorca.
- Iz preračunavanjem sem prišel do sklepa, da je koncentracija naše
plazmidne DNA v vzorcu nekje 175 ng/ul vzorca.
Naloga IV (kloniranje DNA)
- Namen: V vektor pET32a vključiti fragment kokošjega cistatina,
izoliranega iz plazmida pGM1b, pripraviti kompetentne celice in izvesti
transformacijo ligacijskega produkta.
- Namen: Prenesti plazmid v ekspresijski vektor in vnos v
kompetentne celice.
- Namen vaje je ustvariti rekombinatno vektorsko molekulo in jo pomnožiti v bakterijskih celicah v procesu transformacije.
- Namen: Izolacija zapisa za
kokošji cistatin iz pGM1, njegova ligacija v vektor pET32, transformiranje
konstrukta v E. coli
DH5alfa ter njegovo kloniranje.
- Porabo vsakega od encimov smo preračunali glede na porabo za
rezanje plazmida iz bakteriofaga lambda.
- Koncentracija DNA, ki se je nanašala na elektroforezo naj
bi bila med 300 ng in 1,5 ug. Mi smo jo imeli za svoj pGM1b 10,4 ug,
kar je bilo dobolj za 1 žepek.
- Pri pGM1 sta na gelu vidni dve lisi, kar lahko pomeni, da je bilo
nekaj plazmida v superzviti obliki in encim ni mogel dobro rezati.
- Pri plazmidu pET32a so pri linearizaciji nastale druge oblike kot
smo pričakovali. Pri plazmidu pGM1b imamo tri močne lise, kar kaže, da
je bilo rezanje uspešno.
- Dve lisi smo dobili zato, ker cepitev ni potekla na vseh
molekulah, ali pa gre za mešanico rezanega in nerezanega plazmida.
- Pri pET32 so še vidne ostale oblike plazmida, zato ni prišlo do
uspešnega rezanja.
- Nekaj kromosomske DNA je ostalo v žepkih, drugače pa smo dobili velikost fragmentov ~10 kb kar je ~42 ng DNA.
- Precej čuden je položaj najhitrejše lise plazmida pET-23a, saj je
le-ta hitrejša od najhitrejše lise v kontrolnem vzorcu. To bi bila
lahko
superzvita krožna plazmidna DNA.
- potrebna količina enot HindIII: 1 enota=0,2219 pmol. C(pGM1)=20 U/ul.
- Velikost lise z dodatno zvito DNA se je navidez spremenila, kar pomeni, da je encim EcoRI rezal plazmid.
- V ligacijski reakciji smo imeli le 40% celotne vektorske DNA in
DNA inserta, ker smo za nadaljnje reakcije potrebovali manjši
volumen.
- Kompetentne celice smo redčili tako, da smo na LBA plošče nanesli
enkrat 14 ul plazmida za določanje frekvence transformacije, drugič pa
140.
- Insert smo dodali v prej pripravljene kompetentne celice.
- Naš plazmid pET32 zelo verjetno ni dodatno zvit in tako težje vstopa v bkt celice v primerjavi s kontrolnim.
- Pripravili smo tri LB Amp plošče. Na prvo smo nanesli 5 ul
plazmida, na drugo 250 ul plazmida, na tretjo 100 ul našega produkta s
kompetentnimi celicami.
- Kompetentne celice smo redčili tako, da smo na LB Amp
plošče nanesli enkrat 5 ul plazmida za določanje frekvence
transformacije, drugič pa 250 ul. Na eno ploščo pa smo nanesli
naš ligacijski produkt in kompetentne celice. Čez teden dni smo
prešteli kolonije, ki so zrasle na ploščah.
- Na plošči pričakujemo 21 kolonij, če na ploščo
razmažemo 1 ml kulture celic, ki smo jim dodali 1 ul plazmida.
- Iz 1 ml kulture, ki smo jo inkubirali z 2,1 fmol plazmida, smo
odpipetirali 10 ul, dodali 40 ul medija LB in razmazali na
ploščo.
- Na ploščo smo nanesli 250 ul, s tem smo nanesli le 1/4 kolonij in
zato smo na plošči po inkubaciji pričakovali 43 kolonij.
- Z medijem smo redčili 1000x in nanesli na ploščo (5 ul v 245 ul
in od tega smo na ploščo nanesli 50 ul).
- Na eno ploščo smo nanesli naš ligacijski produkt in kompetentne
celice. Čez teden dni smo prešteli kolonije, ki so zrasle na ploščah
ter izračunali frekvenco transformacije.
- 200 ul kulture celic in 800 ul medija LB smo dodali 25 ul ligacijskega produkta.
- Na plošči s pUC19 je zraslo 240 kolonij.
- Na ploščah, na katerih smo preverjali frekvenco transformacije je
zraslo toliko kolonij, da bi bilo štetje le teh opravilo, nehvaležno do
te mere, da se ga močni želji navkljub nismo lotili.
- Eni
skupini pa transformacija kontrolnih vzorcev ni uspela lahko ker:
pozabili dodati insert, grobo delali s kompetentnimi celicami,...
- Frekvence transformacije plazmidov v bakterijske celice E. coli
seva DH5alfa so bile v primerjavi s frekvencami treansformacije v sev
BL21 [DE3] v povprečju višje za faktor 10. V sev DH5alfa se plazmidi
lažje transformirajo, saj ima le-ta sev več nukleaz.
- Na agarnih ploščah, na katerih bi morale zrasti kolonije
ligacijskega produkta, smo dobili veliko zelo majhnih kolonij, ne pa
kolonij, ki smo jih pričakovali.
- Pozitiven rezultat (da kolonija na tem gojišču raste), je
dokaz, da je v procesu transformacije bakterijskh celic prišlo
do vstavitve plazmida (insert z zapisom za rezistenco na Amp) v
kompetentne celice.
- Napaka je bila najbrž v delu: lahko so bile prisotne celice
rezistentne na ampicilin, ker je bilo na ploščah ogromno kolonij.
- V najinem primeru nismo dobili ligacijskega produkta. Kolonije,
ki smo jih analizirali, so po vsej verjetnosti plazmid PMD91. Mislim,
da sta kolega, ki sta dobila 271 kolonij na petrijevki, kjer bi moral
biti samo ligacijski produkt, nekako kontaminirala petrijevko s tem
plazmidom.
- Ligacijske kulture smo
precepili, ter nato kulture, ki so uspevale v gojišču z ampicilinom -
naše transformante analizirali - ugotavljali smo prisotnost plazmida -
konstrukta pET32/kokošji cistatin.
- Pri rekombinantnem
vektorju bi opazili liso samo pri rezanju z EcoRI in HindIII, pri pET32 tudi, a bi
potovali hitreje, pri pGM1 pa bi opazili lisi tako pri prvem rezanju
kot pri drugem, s tem, da bi bila lisa malce hitrejša pri drugem (EcoRI in HindIII).
- Kljub nizki frekvenci transformacije lahko trdimo, da se je
plazmid pUC19 vgradil v gostiteljev genom.
Naloga V (izražanje zapisa)
- Naslov: Rast kvasnih celic v kulturi, indukcija ekspresije in
izolacija ter ekspresija izoliranih proteinov
- Namen: Indukcija ekspresije kokošjega cistatian v E. coli z IPTG, primerjava
izražanja v celotnem celičnem lizatu pred in po indukciji ter
primerjava izražanja v sferoplastni in periplazemski frakciji po
indukciji, na NaDS-PAGE.
- Namen vaje je tudi analiza celičnega lizata in periplazemske
frakcije na NaDS-PAGE ter izvedba testa aktivnosti periplazemskih
frakcij na substrat BANA.
- V periplazmi kvasovk je torej nek protein, ki inhibira papain.
- V 1. žepek sem nanesla DH5alfa s plazmidom pUC19.
- Izražanje induciramo z dodatkom IPTG, ki je analog substrata in
veže represor lac, tako da
RNA-polimeraza E. coli lahko
prične s prepisovanjem zapisa, ki se nato prevaja v protein.
- Inducirali smo ekspresijo proteina, ga izolirali v periplazemski
frakciji in v obliki sferoplastov, da bi lahko pokazali, kje se protein
eksprimira.
- Ločbo smo izvedli na gelu. Izolacija ni uspela, zato smo
prisotnost kokošjega cisteina v obeh frakcijah dokazali z aktivnostnim
testom.
- slika: Analiza periplazemske in sveroplastne frakciej na NADS.
- Tabela 1: merjenje absorbance prekonočne kulture pri 550 nm in 280 nm pred in po dodatku IPTG.
- slika: žepek 1: standard, žepek 4: celični lizat neinduciran,
žepek 5 celični lizat induciran z IPTG
- Na sliki 2 je prikazana NaDS-PAGE inducirane celične in
periplazemske frakcije.
- Izražanje smo inducirali z
IPTG-jem. Imeli smo dva vzorca enega pred in enega po indukciji. Iz
njiju smo pripravili štiri vzorce - dva celotna celična lizata (pred in
po indukciji), ter pri izolaciji periplazemske frakcije dobljeno
celično frakcijo ter periplazemsko frakcijo.
- Podobno je vpliv indukcije na samo koncentracijo proteina na gelu
možno le netočno opredeliti.
- Zaradi izredno slabih rezultatov in vidljivosti, se z gela nič ne
vidi.
- Standard s proteini znanih Mw nam je omogočil potrditi obstoj
cistatina.
- Zapis za kokošji cistein je velik 370 bp, kar pomeni
(370/3*110=12000 Da). /.../ OStale lise, ki so izven pričakovanega
območja za kokošji cistein, so najverjetneje drugi celični
ostanki.
- S pomočjo standarda in vodje vaj smo ocenili koncentracijo
cistatina v periplazemski frakciji 13.5 kDa.
- Slika 2 predstavlja poliakrilamidni gel, na katerem je 9 žepkov.
Prvi žepek je standard, v osmem in devetem pa sta najina vzorca.
- Fragment, ki ga pričakujemo - zapis za kokošji cistatin, se
nahaja med zadnjima dvema lisama našega standarda - to je med 14000 in
6000 in je velik približno 12 kDa. Iz prvega gela vidimo, da pri vzorcu
št. 6 ne vidimo te lise oz. ni tako močno izražena. Vzorcu št. 7 pa smo
dodali IPTG in zasledimo lsio okrog 12 kDa.
- Iz slike 1 je razvidno, da zadnji dve lisi na poliakrilamidnem
gelu ustrezata približno 6000 Da in zadnja lisa 14000 Da. Med tema
dvema lisama je pričakovani kokošji cistatin, kar se vidi tudi iz
rezultatov.
- Celični lizat vsebuje pribl. 80 % vseh periplazemskih
proteinov. /.../ Analiza periplazemske frakcije je pokazala, da je
rekombinantni kokošji cistatin prisoten tudi v periplazmi, kar
sklepamo na osnovi priloženih standardov.
- Ob času nič lise za protein ni bilo, medtem ko je lisa pri našem
vzorcu lepo vidna. Po standardih lahko rečemo, da gre v tem primeru za
kokošji cistatin, ker lisa za kokošji cistatin pride na elektroforezi
okoli 13.5 (to je malo višje, kot bi dejansko morala – 14.4).
- Na sliki 1 je NaDS-PAGE, in sicer v 1. žepku: celotni celični
lizat pred indukcijo, 2. žepek: celotni celični lizat po indukciji, 3.
žepek: (...). V 2. žepku opazim močnejše lise in tudi še 2 dodatni lisi
proti koncu gela, ki lahko predstavljata kokošji cistatin. 3. žepek,
kjer se nahaja periplazemska frakcija, je brez vidnih proteinskih lis.
Zato z gotovostjo ne morem trditi, da je najhitrejša lisa 2. žepka prav
cistatin.
- Vidimo, da je v celotnem celičnem lizatu prišlo do izražanja
kokošjega cistatina po indukciji z IPTG.
- V drugem delu vaje smo izvedli elektroforezo celične in
periplazemske frakcije ter poskušali ugotoviti, koliko proteina je
prisotnega v topni (periplazma), koliko pa v netopni obliki (celice).
- Iz slike 2 je razvidno, da je pri celičnem preostanku in pri
periplazmi veliko lis. To je bilo za pričakovati - veliko celičnega
materiala sta vsebovala vzorca. Pri periplazmi je seveda malo manj lis.
- Iz gela, na katerem smo izolirali celične in periplazemske
frakcije, je razvidno, da je več proteinov v celičnih frakcijah, kar se
ne ujema s pričakovanji. [na
priloženem elektroferogramu pa je bilo več lis pri periplazemski
frakciji kot pri celičnem preostanku]
- Izolacija periplazemske
frakcije ni dobro vidna, saj je očitno večji del proteinov ostal v
periplazmi.
- Iz slike je razvidno, da pred dodatkom induktorja IPTG ni prišlo
do proizvodnje proteinov, medtem ko so se po indukciji sintetizirale
večje količine proteina z maso približno 15 kDa.
- Kokošji cistatin je bil v manjših količinah prisoten tudi pred
dodatkom IPTG, verjetno zaradi nizkih ravni ekspresije lac-represorja v celici in
prisotnosti konstitutivnega promotorja Plpp na pGM1b.
- Fragment, ki ga pričakujemo - zapis za kokošji cistatin se
nahaja med zadnjima dvema lisama našega standarda, to je med
14000 in 6000 in je velik približno 12 kDa. Iz prvega gela vidimo, da
pri vzorcu št. 2 ne vidimo te lise pri vzorcu št. 3 pa
smo dodali IPTG in zasledimo liso okoli 12 KDa. IPTG torej pomaga bolj
izražati zapis za kokošji cistatin.
- Če pogledamo absorbanco pri testu BANA, lahko vidimo, da se pri
pET in pUC ne spreminja, ker ni rekombinantnega proteina, ki bi
inhibiral, zato je aktivnost prisotna povsod.
- Pri najinem vzorcu so absorbance nekoliko nezanesljive, saj je
aktivacija prenizka že pri sami kontroli.
- Iz tabele je razvidno, da je v sevu SCS1 E. coli prišlo do
popolne inhibicije papaina.
- Če primerjamo DH5alfa brez inserta in DH5alfa z insertom (v
periplazmi) vidimo, da tu vrednosti malo padajo.
- Naša kontrola ni kazala pretirane inhibicije, kar je v redu.
- Več kot smo dodali periplazemske frakcije, več papainov je bilo
inhibiranih.
- Papain sam brez inhibitorja ne more biti bolj aktiven kot če vzorcu dodamo inhibitor.
- Če dodamo 200 ul vzorca, je
inhibicija skoraj 100%. Torej predvidevamo, da je v vzorcu periplazme
res nastal želeni produkt (cistatin).
- Promotor je očitno deloval
že brez IPTG-ja.
Naloga VII (polimorfizem STR)
- Naslov: Pomnoževanje polimorfizma STR DNA, izolirane iz človeških
celic
- Namen: S PCR namnožiti STR na 3. kromosomu in analizirati dobljene
produkte s SDS-PAGE.
- Namen vaje je bila izolacija lastne DNA iz celic ustne slinavke in pomnožitev enega od polimorfnih segmentov s PCR:
- Namen je seznaniti se z metodo, ki nam pomaga pri iskanju
obsojencev, očetovstva in še kje.
- Naš namen je bil izolirat DNA iz celic ustne slinavke, pomnožit
specifično zaporedje z uporabo metode PCR in določit število ponovitev
zaporedja GATA pri posameznikih na 3. kromosomu.
- Pri vaji naj bi pridobili genomsko DNA iz celic ustne sluznice in
s pomočjo PCR pomnoževali enega izmed tandemskih segmentov ter ga
ločili z elektroforezo.
- Kot rezultat smo dobili 8% poliakrilamidni gel.
- PAGE produktov PCR ni uspela, ker na gelu nismo dobili obeh lis
za barvila. Vzrok je naj verjetneje bilo predolgo segrevanje. Dolgo pa
smo segrevali, da na gelu ne bi dobili preveč lis.
- Vzorec genomske DNA smo analizirali z agar. elektroforezo. V
žepku se vidi lisa, ki bi lahko bila kromosomska DNA, lahko bi bila pa
tudi plazmidna DNA.
- Na vrhu gela opazimo genomsko DNA (PCR je uspel).
- Moj vzorec se nahaja v 11. žepku. V njem ni vidne nobene lise, pa
tudi
po gelu, kjer naj bi potovala DNA, lise ni.
- Odločili smo se, da naredimo analizo na agaroznem gelu, da
ugotovimo, ali je kaj kromosomske DNA in ali je prisotno kaj RNA. Torej
je tisto, kar se sveti, DNA ali RNA. RNA se v agaroznem gelu hitro
odcepi, DNA pa ostane v žepkih.
- Iz slike elektroforeze je razvidno, da je genomska DNA bila
izolirana, da so se primerji vezali, prisotne pa so tudi
nekakšne druge snovi, ki motijo interpretacijo.
- Na žalost rezultatov nismo dobili, zato smo se lotili vzrokov
našega neuspeha.
- Iz rezultatov sklepamo, da je bilo nekaj narobe v postopku
jemanja vzorca celic, lahko pa so bile napake tudi kje drugje.
- Naš elektroforezni gel ni dober, zato na osnovi teh rezultatov ne
morem sklepati na pogostost posameznih ponovitev v populaciji.
- Na podlagi zgornje slike lahko težko sklepam na kaj konkretnega,
vse je bolj ali manj špekulacija.
- Verjetno so se zaradi nezadostne temperature pri PCR tvorili
dimeri ali pa dodatne sekundarne strukture.
- Primerji bi se lahko prijeli na neko mikrobno DNA, sa je v ustih
veliko mikrobnih celic, ki jih je lažje zajeti v vzorec kot pa pastne
celice z genomsko DNA.
- Barvili v nanašalnem pufru sta bili bromfenolmodro
(označuje potovanje fronte, vijoličasta barva 45 bp velika spojina) in
ksilencianol (svetlo modra barva, 140 bp).
====================
Nazaj na vaje iz
tehnologije rekomb. DNA.
Vprašanja, komentarji: Marko
Dolinar