Vaje iz predmeta Struktura proteinov pri
prof. dr. Igorju Križaju se bodo začele .22. februarja 2010. Vaje
potekajo v laboratoriju na Vegovi 4 (NTF-KII). S seboj prinesite
laboratorijsko haljo že na prvo vajo.
Urnik si lahko ogledate na spletni strani FKKT. Če imate kakršno koli
vprašanje se obrnite na asistentko Anjo Pucer (anja.pucer@ijs.si)
ali asistenta Janeza Kokošarja (janez.kokosar@ijs.si)
.
Kako bodo potekale vaje?
Vsaka skupina študentov
bo razdeljena na tri podskupine (3-4 študentje) od katerih bo vsaka dobila po
en neznan protein (A, B ali C). V prvi vaji boste določili osnovne lastnosti
dobljenega proteina, to je njegovo molekulsko maso, izoelektrično točko,
število in vrsto podenot, ki ga sestavlja, posttranslacijske modifikacije
(glikozilacija). Pri vajah, ki bodo sledile, se boste najprej seznanili z
metodami za modifikacijo specifičnih aminokislinskih ostankov v proteinu.
Analizirani protein boste reducirali in mu zaščitili –SH skupine
(piridiletiliranje, karboksimetiliranje). Vzorec boste nato razsoljevali
bodisi z visokotlačno tekočinsako kromatografijo (HPLC) na koloni z obrnjeno
fazo, z gelsko filtracijo na PD10 koloni ali s spiranjem oborjenega proteina.
Alkiliran protein boste razgradili s proteinazami različnih specifičnosti ali
na kemijski način in nastale fragmente ločili s HPLC na koloni z
obrnjeno fazo ali z poliakrilamidno gelsko elektroforezo (PAGE) v prisotnosti
detergenta natrijevega dodecil sulfata (NaDS). Nekaterim peptidom bomo
določili aminokislinsko zaporedje s postopkom Edmanove razgradnje na
avtomatskem proteinskem sekvenatorju. Peptide čiščene z NaDS-PAGE boste pred
sekvenčno analizo iz gela
prenesli na za sekveniranje primeren nosilec - poliviniliden difluoridno
(PVDF) membano (western prenos). Po
detekciji peptidov na PVDF membrani, boste lise izrezali in jih sekvenčno
analizirali. S pomočjo računalnika boste dobljena aminokislinska zaporedja
primerjali s sekvenčnimi bazami in tako identificirali protein, ki ste ga
dobili v analizo. To je tudi rezultat, ki ga od vas zahtevamo v poročilu.
Pisanje poročil
Po vsaki opravljeni vaji je potrebno napisati poročilo
o opravljeni vaji (razen nekaj izjem, je navedeno pri posamezni vaji). Kaj
naj poročilo vsebuje imate v navodilu za pisanje poročila. Poročilo oddate najkasneje
do četrtka zvečer. Pri pisanju poročil bodite kar se da kratki in
jedrnati...
Pogoj za pisanje kolokvija je končno poročilo, ki povzame delo skozi vse vaje
(razen 2. vaje, kjer niste delali z vašim proteinom).
NOVO
Sedma vaja bo potekala v torek, 6.4.2010 od 8.30 do 10.30 na IJS.
Ogledali si boste določanje
aminokislinskega zaporedja, masni
spektrometer in določanje 3D strukture
proteinov.
Ogled na IJS bo potekal v štirih skupinah! LINK!!
Skupine 1, 2 in 3 začnejo z ogledom ob
8.30. Skupina 4 začne z
ogledom ob 9.30!
Končno
poročilo oddajte najkasneje do torka, 13. aprila 2010 zvečer! Navodila in
napotke za pisanje končnega poročila imate v priloženi PDF datoteki!
Dodatni material
Skripta za vaje iz strukture proteinov (primarna
struktura).
Kolokvij
2005.pdf
Končna ocena je sestavljena iz:
20% - sprotna poročila, kjer se ocenjuje poleg še vaše
pripravljenost na vaje
30% - končno poročilo, kjer se ocenjuje še vaše splošno
sodelovanje na vajah
50% - kolokvij
1. VAJA
Umeritveni krivulji za gelsko kromatografijo:
Izoelekrični
fokusing:
Barvanje s
Schiffovim reagentom:
Slike SDS
- PAGE gelov in uporabljen proteinski standard:
Skupina 1
Skupina 2
Skupina 3
Pri tem delu vaje (SDS-PAGE) naj vse skupine v
poročilu komentirajo rezultate 1. skupine.
Proteinski
standard
3. VAJA
Skupina 1:
Protein A
Protein B (prvi
nanos)
Protein B (drugi
nanos)
Skupina 2:
Protein A
Protein B (prvi
nanos)
Protein B (drugi nanos)
Skupina 3:
Protein A
Protein B (prvi
nanos)
Protein B (drugi
nanos)
Aminokislinska analiza neznanega proteina
4. VAJA
Skupina 1:
Protein B –
(HPLC) cepitev z tripsinom (prvi nanos)
Protein B –
(HPLC) cepitev z tripsinom (drugi nanos)
Protein B – (HPLC)
cepitev z V-8
Skupina 2:
Protein B –
(HPLC) cepitev z tripsinom (prvi nanos)
Če podatkov niste uspeli pridobiti, v poročilu to tudi napišite!
5. VAJA
Skupina 1:
Protein A – PVDF
membrana (CBB)
Protein C – PVDF
membrana (CBB)
Protein C – gel (cepitev
z V-8 in Lys-C)
Skupina 2:
Protein A – PVDF
membrana (CBB)
Protein C – PVDF
membrana (CBB)
Protein C – gel (cepitev
z V-8 in Lys-C)
Skupina 3:
Protein A – PVDF
membrana (CBB)
Protein C – PVDF
membrana (CBB)
Protein C – gel (cepitev
z V-8 in Lys-C)
Pri interpretaciji rezultatov si pomagajte s slikami gelov
iz prve vaje ter s slikami gelov/membran drugih skupin.
V nekaterih primerih so bile proteinske lise bolje vidne
takoj po barvanju, tako da upoštevajte tudi vaše (morebitne?) zapiske o
položaju/številu lis.
Slik gelov barvanja s koloidnim srebrom nismo skenirali,
ker na teh gelih ni bilo prisotnih proteinskih lis (upoštevajte pri
interpretaciji).
Geli barvani s ZnCl so bili premalo kontrastni, da bi jih
lahko skenirali - pri interpretaciji rezultatov upoštevajte vaše zapiske.
Uporabljen
proteinski standard – skupina C (barvanje gela z CBB)
6. VAJA
Vse skupine:
Protein
A: cepitev z CNBr (gel) (slika gela iz lanskih vaj)
V poročilu vse skupine interpretirajte priloženo sliko, ker lise na
vaših gelih po skeniranju niso bile vidne.
Vse skupine:
Protein
B: cepitev z CNBr (membrana)
V poročilu vse skupine interpretirajte priloženo sliko, ker lise na vaših
membranah niso bile vidne.
Skupina 1:
Protein C:
CNBr cepitev (HPLC)
Protein C:
kontrola
Skupina 2:
Protein C:
CNBr cepitev (HPLC)
Protein C:
kontrola
Skupina 3:
Protein C:
CNBr cepitev (HPLC)
Protein C:
kontrola
7. VAJA
V datoteki najdete masni spekter,
ki ga potrebujete za rešitev 22. naloge!
